卓上型NMRによる発酵のモニタリング
発酵とは、微生物の働きによって製品を変化させたり生成したりするプロセスです。発酵は、パン、ヨーグルト、酢、ワインなど、食品の加工や保存に利用されます。発酵は自然に起こることもあり（例えば冷蔵庫で牛乳が酸っぱくなる現象など）、特定の微生物を加えることで制御された形でも行われます。チーズやワインの製造は制御された発酵の例です。
産業プロセスにおいては、発酵の進行状況をモニタリングすることが重要です。なぜなら、汚染による発酵の制御失敗が製品の全バッチを台無しにする可能性があるからです。
ここでは、Spinsolve 卓上型NMRを用い、糖がエタノールへと発酵によって変化する過程を、サンプル処理を一切行わずにモニタリングする方法を示します。制御された発酵と自然発酵の異なる結果についても実演しています。
発酵プロセス
発酵は複数の段階を経て進行します。
第一段階では、二糖類スクロース（C₁₂H₂₂O₁₁）がグルコースとフルクトースに分解されます：
C₁₂H₂₂O₁₁ + H₂O → 2 C₆H₁₂O₆
次に、グルコースとフルクトースは、いずれも酵母の働きによってエタノールと二酸化炭素に分解されます：
C₆H₁₂O₆ → 2 C₂H₅OH + 2 CO₂
この二酸化炭素の生成が、発酵中に見られる特徴的な気泡の原因です。
酸素の存在下では、酢酸菌（アセトバクター）がエタノールを酢酸に変換します：
C₂H₅OH + O₂ → CH₃COOH + H₂O
サンプル準備と測定
未処理のフレッシュリンゴジュースのバッチから2つのサンプルを3リットルのプラスチックボトルに移しました。そのうちの1つのサンプルには、制御された発酵のためにビール酵母を接種しました。もう一方のサンプルは無処理のままにしておき、自然発酵を進行させました。両方のボトルは室温で保管しました。
自然発酵サンプルのスペクトル例を下記図1に示します。
図１ 自然発酵させたフレッシュリンゴジュースのNMRスペクトル
フレッシュジュースと発酵ジュース(シードル)サンプルのNMRスペクトル
完全に発酵したサンプル（ジュースがシードルに変化したもの）のNMRスペクトルを図2に示しています。これは、新鮮なジュースのスペクトルとともに表示されています。すべてのスペクトルにおいて、4.7 ppmに大きなピークが見られ、これは水に由来するものです。
縦方向の拡大により、1〜4 ppmの間に複数の小さなピークが見られます。これらのピークを図2で示しています。
図2：20日間の自然発酵および制御発酵後のフレッシュなリンゴジュースとシードルのNMRスペクトル。ジュースおよびシードルのスペクトルは顕著な水のピークが支配的だが、縦方向に50倍拡大することで、より小さなピークの存在が明らかになり、それらはすべて識別可能です。ピークの識別を補助するために、99%エタノール／水混合物のスペクトルも示しています。
アルコール濃度と変換率の測定
1.2 ppmおよび2.0 ppmに見られるCH₃ピークは分離が明確であり、エタノールおよび酢酸の定量測定に使用できます。測定された体積濃度のグラフは図3に示されています。制御された発酵の特徴として、変換率が高く、二次発酵が見られない点が挙げられます。
結論
Spinsolve 卓上型NMR分光計を用いて、未処理のフレッシュリンゴジュースの発酵プロセスをモニタリングすることができました。制御された発酵と自然発酵の明確な違いが検出されました。
サンプルは、発酵容器から直接採取され、処理や精製は行っていません。このことから、Spinsolve 卓上型NMR分光計が、オンラインでのプロセスモニタリングツールとして容易に利用可能であることが示されました。
