蛍光干渉は、ラマン分光法を使用する際によく直面する課題です。蛍光干渉によってスペクトルのベースラインが上昇し、信号対雑音比（SNR）が低下します。場合によっては、蛍光干渉がラマン信号を完全に覆い隠してしまうこともあります。
略語
蛍光干渉を抑える一般的方法の一つは、より長波長の励起光を使用することです。
ラマン散乱強度は励起レーザーの周波数の4乗に比例するため、長波長を使用するとラマン信号が弱くなるという課題があります。(1)(2)
長波長励起レーザーを用いると、通常、蛍光干渉は減少しますが、ラマン信号強度も大幅に低下します。
一方、分子蛍光は主に300nmより長波長で観測されるため、UV共鳴ラマン分光法（UV-Raman）は有望な測定結果を得られる可能性があります。ただし、UV励起によってサンプルが劣化しやすく、またUV領域での強い吸収によりラマン信号強度が低下することがあります。(3)(4)(5)(6)
励起波長の最適化に加え、蛍光干渉を軽減するための様々な技術も開発されています。蛍光抑制技術は大きく5つのカテゴリに分類できます。(7)(2)
時間領域法には、タイムゲーティング（time-gating）などがあります。これらは蛍光放射とラマン散乱の時間的差を利用する方法です。場合によっては、短波長励起レーザーの使用が可能になり、ラマン散乱強度を高めつつ蛍光干渉を大幅に抑えることができます。(8)(9)
タイムゲーティングではパルスレーザーが用いられ、パルス状の応答が生成されます（下図参照）。
この応答を選択的にサンプリングすることで、ラマン散乱が主に存在する時間帯の情報を収集し、蛍光干渉の大部分を除外することが可能です。特に、蛍光の遅延がラマン散乱より長く、両者の時間的重なりが小さい場合に効果的です。
上：Timegating(時間ゲーティング)による蛍光抑制は、蛍光信号を時間的に除外することを原理としています。
最新のSPAD（Single-Photon Avalanche Diode）ベースの時間領域技術では、検出器を特別に冷却せずとも、卓上型装置の小型化を維持しつつサブナノ秒の時間ゲートを実現しています。最新のSPAD検出器は、ほとんどのラマン分光法において十分なスペクトル分解能を提供します。(10)(11)(12)
周波数領域法は、時間領域法とフーリエ変換で関連しています。高周波変調下での蛍光とラマン散乱の応答差を利用する方法です。ラマン散乱は励起光の高周波変調にほぼ瞬時に追従しますが、蛍光放射は遅い応答を示します。
この技術の目的は、ラマン散乱成分を分離し、蛍光干渉を最小化することです。
周波数領域技術は有望ですが、システムが複雑になりやすく、広いスペクトル範囲では効果が低下する場合があります。また、蛍光信号内のノイズ（ショットノイズなど）がラマンスペクトルに影響することもあります。位相無効化技術では、高いラマン信号強度が必要になる場合があります。(10)(11)(12)
波長領域法は、蛍光が広い波長範囲に広がるのに対し、ラマン信号は励起波長と密接に関連していることを利用します。代表的手法には、シフト励起ラマン差分分光法（SERDS）や差引シフトラマン分光法（SSRS）があります。(7)(2)(12)
SERDS：少なくとも2つのわずかに異なる励起波長を用い、蛍光をほぼ相殺した差分スペクトルから、元のラマンスペクトルを再構築します。結果として、スペクトルの質が向上します。(7)(2)(12)
SSRS：波長可変レーザーを使わず、非常に近接したスペクトル位置で測定する方法です。
WMRS（波長変調ラマン分光法）：ラマン信号取得時に励起波長をわずかに変調します。
これらの波長領域手法では、データ取得後に計算処理が必要であり、スペクトルの再現性はノイズレベルに依存します。(7)(2)(12)(13)
数学的手法は蛍光干渉抑制の一般的手段です。ただし、処理データにアーティファクトが生じる場合があり、収集情報の妥当性に影響することがあります。(13)
蛍光がすでにスペクトルを歪めている場合、計算手法によるSNR改善能力は限定的です。(2)
自動ベースライン補正は最適結果を出さない場合があり、サンプルに応じた補正パラメータを決定するのが難しいこともあります。(2)
それでも、視覚化や他技術との組み合わせにおいて後処理として有効です。
測定前にサンプルをレーザー光にさらすことで蛍光を低減します。ラマン散乱は維持されますが、高出力光退色レーザーはサンプル変質のリスクがあります。再現性のある光退色は難しく、校正モデルに影響することがあります。(7)(14)(15)
蛍光干渉を抑えつつラマン信号を増強する方法です。適切な基板やナノ構造の使用が必要で、タイムゲーティング技術と組み合わせることで有望な結果が得られます。(16)(17)(18)
濁ったサンプルや層状サンプルに有効です。照射と収集の空間オフセットを利用し、蛍光や不要信号を低減しながら深部情報を取得できます。(19)(20)
2〜3本のレーザーを用い、分子振動に共鳴するコヒーレントラマン応答を生成します。高速収集が可能ですが、狭帯域の情報のみ得られます。非共鳴バックグラウンドが干渉する場合もあります。複数レーザーのアライメントが難しく、コスト増や操作上の課題があります。(21)(22)(2)
CARSを使わず実施可能で、蛍光干渉が少ない領域を測定。ただし、室温下では信号が弱いのが課題です。高温条件下では信号寄与が増え、有効なデータ取得が可能です。(23)(24)(25)
最適な蛍光抑制技術は、用途やサンプルにより異なります。一部の技術は高価な装置や専門知識を必要とします。計算手法は幅広く適用可能ですが、抑制能力は限定的です。
選択の際は、用途、サンプル特性、予算、装置操作の知識、装置サイズや携帯性、技術の組み合わせ可能性などを総合的に考慮することが重要です。
※Bryan Heilala氏による原文とReferencesは、こちらからご覧ください。